Na última década, o sequenciamento de DNA de nova geração combinado a novas metodologias no estudo da morfologia, possibilitaram os estudos da biodiversidade em grande escala, com algumas dezenas de milhares de espécimes (indivíduos), diminuindo imensamente o tempo e os custos para a identificação de espécies.
Um dos maiores projetos de pesquisa para o estudo da biodiversidade já realizados, integrando morfologia e biologia molecular, está em andamento no estado do Amazonas, na Amazônia Central, para o estudo da diversidade de espécies de insetos que vivem desde o solo até a copa das árvores, a cerca de 30 metros de altura.
Com a coleta de cerca de 2 milhões de insetos ao longo de 14 meses, entre julho de 2024 e setembro de 2025, na Reserva Biológica ZF2 (RBZF2) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), a 80 km ao norte de Manaus (AM), o projeto BioInsecta — Biomonitoramento de Insetos em Florestas Tropicais — deverá se tornar um marco de referência na literatura científica mundial, tanto em relação ao número de espécies coletadas quanto identificadas e com DNA sequenciado, bem como de novas espécies reveladas.
Uma das grandes contribuições do estudo será complementar os bancos de dados moleculares (DNA) para um grande número de espécies de insetos da Amazônia, em uma escala sem precedentes na ciência, destaca Daniel Dias Dornelas do Carmo, pós-doutorando apoiado pela Fapesp no Departamento de Biologia da USP de Ribeirão Preto (SP), instituição sede do BioInsecta.
Com base na análise inicial do sequenciamento de 180 mil espécimes da RBZF2, mais de 21 mil espécies de insetos já foram reconhecidas, e a estimativa é de que mais de 95% dessas espécies ainda sejam desconhecidas da ciência.
Um número gigantesco de sequências de DNA de espécies previamente desconhecidas da Amazônia serão inseridas no GenBank, o maior banco de dados molecular mundial, permitindo que pesquisas futuras utilizem dados moleculares para estudar a diversidade de insetos na Amazônia.
Carmo é o coordenador geral de sequenciamento de DNA do projeto BioInsecta, que realizará o sequenciamento de um trecho do DNA (barcode) de 320 mil insetos coletados na RBZF2. No futuro, “se o pesquisador obtiver a sequência de DNA para o grupo (de insetos) que estuda, poderá comparar com os bancos de dados, que não estarão tão incompletos, permitindo encontrar sequências similares e até mesmo identificar determinada espécie através do uso de dados moleculares”, explica.
Daniel do Carmo no alto da torre meteorológica da Reserva Biológica ZF2 do INPA, a 40 m de altura. (Créditos: Leandro Magrini/Bio Insecta)
Além de Carmo, o estudo compreende uma rede multidisciplinar de pesquisa que já conta com mais de 250 cientistas de 88 instituições, 56 nacionais e 32 internacionais. O projeto é apoiado pela Fapesp no âmbito do Programa Biota, e realizado em parceria com o BioDossel (Insetos na Copa das Árvores), um Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia apoiado pelo CNPq com sede no INPA, em Manaus, que em conjunto com a Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), realizará o sequenciamento do DNA de mais 280 mil insetos coletados em outros dois pontos da Amazônia Central — um local a oeste do Rio Negro (Iranduba/AM), e outro ao sul do Rio Solimões (Careiro Castanho/AM).
Em um mundo de rápidas transformações ambientais causadas por atividades humanas como degradação dos ecossistemas e aquecimento global, conhecer o número de espécies que vivem em áreas delimitadas nas florestas tropicais, como essas espécies estão distribuídas nos estratos (alturas) da floresta e o tamanho de suas populações, podem ajudar a identificar áreas prioritárias para a preservação, reconhecer espécies ameaçadas e orientar investimentos e estratégias para o manejo e restauração dos ecossistemas.
A entrevista é de Leandro Magrini, biólogo e doutor em Biologia Comparada pela Universidade de São Paulo. É bolsista Mídia Ciência Fapesp e pós-doutorando da FFCLRP/USP.
Estudos de biodiversidade utilizando dados moleculares combinados a dados morfológicos tiveram um grande desenvolvimento nas últimas três décadas. Qual a principal novidade trazida pelo projeto BioInsecta em relação a esses estudos?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – O BioInsecta é um projeto que visa descrever a biodiversidade. Basicamente, o nosso papel como taxonomistas é conhecer a biodiversidade, conhecer os organismos que existem no planeta, e onde os organismos e as espécies estão distribuídos; quem são esses organismos e as espécies que já são conhecidas. Descrever eventuais espécies novas e, em muitos casos, (revelar) as relações evolutivas entre as espécies.
Para isso, podemos lançar mão de uma série de ferramentas que fornecem evidências que ajudam a reconhecer as espécies e a delimitar possíveis espécies novas. Podemos usar dados anatômicos ou morfológicos — basicamente a estrutura física do corpo dos insetos —, mas também podemos usar outras fontes de evidência, como comportamento e dados moleculares. Isso já é realizado para diversos grupos de organismos que têm os seus respectivos especialistas, mas o grande diferencial do BioInsecta é a escala.
Quando fazemos um trabalho taxonômico com determinado grupo de organismos, podemos usar dados moleculares e morfológicos para conseguir mais evidências para suportar (confirmar ou não), por exemplo, que determinada espécie é uma espécie nova.
No BioInsecta, usamos um novo tipo de tecnologia, que já tem uns 10-12 anos, chamado sequenciamento de nova geração (ou terceira geração). Esse sequenciamento permite a obtenção de milhares de sequências de DNA de um grande número de organismos (ao mesmo tempo).
Estamos amostrando (coletando) em um ponto da Amazônia, a Reserva Biológica ZF2 (RBZF2) do INPA, a cerca de 80 km ao norte de Manaus, e obtendo o DNA de um grande número de espécimes (indivíduos), em uma escala nunca antes realizada para o estudo dos insetos que vivem acima do nível do solo. Já foram sequenciados cerca de 300 mil indivíduos, número que chegará a 320 mil no projeto BioInsecta, totalizando 600 mil insetos em parceria com o projeto BioDossel.
Esses dados moleculares (DNA) serão depois comparados com a morfologia, de forma que possamos usar essas duas fontes de evidência para descobrir eventuais espécies novas, por exemplo, de um modo muito mais rápido do que tem sido realizado até então.
O que é a informação de DNA barcoding (COI)?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – A palavra barcode vem do inglês, significa código de barras. A ideia original é que fosse um código de barras para conseguir identificar a vida na Terra. E para isso, os proponentes do DNA barcode procuraram uma sequência que fosse conservada entre os organismos, ou seja, similar o bastante para poder ser comparada entre dois organismos. Mas a sequência também precisa ter variação suficiente para permitir que os organismos sejam reunidos em grupos, isto é, dizer que determinado grupo de organismos (espécies) é mais mais próximo (aparentado) entre si, do que de um outro grupo.
Para os animais, o gene escolhido para o DNA barcode é o COI, citocromo oxidase I, um gene mitocondrial. Por ser um gene associado à respiração celular, não pode ter um grande número de mudanças (mutações) aleatórias porque isso aumenta muito a probabilidade de tornar o organismo inviável. Mas, ao mesmo tempo, o gene COI tem um número razoável de substituições neutras, isto é, modificações que não trazem prejuízo ao organismo e que permitem fazermos esse agrupamento ou separação entre organismos. E esse gene tem sido usado com relativo sucesso para a identificação dos táxons — as espécies já descritas.
Em que consiste a metodologia de taxonomia integrativa e triagem reversa usada na pesquisa?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – Temos uma quantidade muito grande de dados sendo obtida, para um grande número de espécies, e é o sequenciamento de nova geração (SNG), ou de terceira geração, que torna isso possível. A capacidade do SNG de fornecer um grande número de sequências de DNA permitiu o uso de um método denominado taxonomia integrativa com triagem reversa. Em que isso consiste? Quando pegamos, por exemplo, uma amostra de armadilha Malaise — basicamente uma tenda que colocamos na floresta para coletar insetos —, podemos ter milhares de insetos em um único pote (que coleta os insetos) da armadilha.
Quando esses potes coletores vão para o laboratório para serem analisados pelos taxonomistas, geralmente o processo de triagem — a separação dos insetos em seus grupos ou categorias taxonômicas (ordens, famílias, gêneros) — é uma tarefa muito difícil e exaustiva. E, muitas vezes, acabamos tendo potes e mais potes acumulados no laboratório, porque não há recursos humanos (especialistas) suficientes para separar esse material.
É aí que entra a triagem reversa. Utilizando esse potencial do SNG para obter um grande número de sequências de DNA, conseguimos obter dados moleculares de uma forma muito rápida, antes mesmo de olhar o material — isto é, analisar a morfologia dos indivíduos.
Depois, utilizando ferramentas computacionais, conseguimos separar as sequências (de DNA barcoding) em agrupamentos de similaridade. O computador informa que as sequências (dos indivíduos) A e B são mais próximas (ou similares) entre si do que as sequências (dos indivíduos) C, D e E, por exemplo. Então, A e B formam um grupo, e C-D-E formam um outro grupo.
O grupo proposto pelo DNA barcode (COI) é o que chamamos de hipótese inicial de espécie. Assim, consideramos que os indivíduos A e B constituem uma espécie, e os indivíduos C, D e E constituem outra espécie. É a similaridade da sequência do gene COI que nos dá essa informação.
A próxima etapa é mandar essas hipóteses iniciais de espécies (ou seja, os indivíduos agrupados) para um especialista que vai utilizar outras fontes de dados, entre eles dados morfológicos, para avaliar e, finalmente, dizer se os dois grupos de indivíduos são, de fato, duas espécies ou não.
Em estudos com um número muito grande de insetos, demora muito tempo para os taxonomistas conseguirem processar esse material, e a triagem reversa acelera muito esse processo.
Como funciona a tecnologia MinION usada para o sequenciamento em grande escala e quais suas vantagens?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – O MinION é um sequenciador de nova geração que nós utilizamos. Ele tem uma flow cell que é um reagente orgânico. Nessa flow cell há uma série de poros que contêm uma enzima ativa que se liga ao DNA, e o lê como corrente elétrica. Depois, essa corrente elétrica é transformada no computador em bases nitrogenadas, as bases do DNA (Adenina, Timina, Citosina e Guanina).
Antes do SNG, a forma de sequenciamento era o sequenciamento Sanger, em que só era possível sequenciar um organismo (indivíduo) por vez. O diferencial do MinION e de todo tipo de SNG é que conseguimos utilizar marcadores moleculares, que nada mais são do que etiquetas moleculares que permitem que sejam reunidas todas as amostras (de DNA) sendo estudadas em um único frasco (com menos de 5 ml). Depois, conseguimos separar essas moléculas de DNA e associá-las com os indivíduos de onde vieram, através de etiquetas moleculares.
É como se prendêssemos uma etiqueta na sequência de DNA. A etiqueta também é um conjunto de sequências moleculares (DNA). Temos uma planilha no computador que informa a qual indivíduo pertence cada etiqueta, e assim podemos reunir todas as amostras de DNA em um único tubinho.
Uma pequena amostra do líquido desse tubo, que contém todas as sequências de DNA de interesse, é inserida no MinION (Oxford Nanopore Technology) — um sequenciador portátil menor do que um celular. Amostras de DNA de mais de 10 mil indivíduos podem ser sequenciadas no MinION ao mesmo tempo.
Depois que as sequências de DNA passam pelo MinION e obtemos as bases nitrogenadas no computador, usamos ferramentas de bioinformática que utilizam as informações das etiquetas moleculares para separar as sequências e associá-las aos respectivos indivíduos aos quais pertencem.
Outra diferença é em relação aos custos. Enquanto o sequenciamento Sanger custa entre 5 e 10 dólares por espécime (indivíduo), nosso protocolo tem um custo estimado entre 2 e 4 dólares por indivíduo.
Com uma equipe que conta com sete pesquisadores entre pós-doutorandos (3) e pessoal de apoio técnico de nível superior (4) no BioInsecta, estão sendo sequenciados 10 mil insetos (DNA barcode) em um período de cerca de 12-15 dias. Depois disso, são necessários mais 2-3 dias para a obtenção dos resultados das análises computacionais do sequenciamento.
Quais os principais obstáculos para a obtenção dos dados moleculares e que soluções foram encontradas?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – Falar de obstáculos em um projeto do tamanho do BioInsecta é uma tarefa difícil, porque acabam sendo muitos. Isso é normal em um laboratório (de biologia) molecular. As coisas dão errado mesmo, e por diferentes motivos: às vezes, as amostras que pensávamos estarem bem preservadas não estão tão preservadas assim. Outras vezes, os reagentes usados não têm o sucesso que era esperado. Também existem diversos tipos de erro humano que podem acontecer. E no nosso projeto não é diferente.
Equipe de pesquisadores da área de biologia molecular (sequenciamento de DNA) dos projetos BioInsecta e BioDossel, reunidos durante Seminário realizado no INPA, Manaus (AM), em dezembro de 2025. (Créditos: BioDossel)
Mas temos várias formas de verificar a integridade do DNA. Uma delas é o gel de agarose, que usamos para verificar se o fragmento de DNA de nosso interesse — o DNA barcode para o gene COI — está sendo obtido no sequenciamento, isto é, a sequência correta. Muitas vezes, o gel mostra que não estamos obtendo a sequência correta ou que não estamos obtendo sequência nenhuma.
Isso já aconteceu e vem acontecendo. Algumas das amostras têm um sucesso abaixo do esperado, que é em torno de 70%. E quando isso acontece, investigamos o que aconteceu. Às vezes é a amostra, outras vezes o reagente, ou até mesmo alguma coisa que usávamos na limpeza do material, como as placas usadas para a extração de DNA, que estavam comprometendo os resultados.
Por exemplo, no começo a limpeza das placas (reutilizáveis) que usamos para a extração do DNA era com água sanitária, e quando tivemos os primeiros erros (para a obtenção de DNA), mudamos o protocolo de limpeza para evitar o risco de perder o DNA.
Qual o impacto esperado do projeto em relação aos bancos de dados moleculares para a identificação de espécies de insetos e para estudos de biodiversidade em grande escala?
Daniel Dias Dornelas do Carmo – Estamos trabalhando com um volume muito grande de dados, e isso vai se refletir nos bancos de dados para essas sequências moleculares. Existem no mundo diversos bancos de dados, que são repositórios de sequências moleculares.
Como toda pesquisa científica, é necessário que uma pesquisa com dados moleculares possa ser replicada. Para isso, essas sequências (moleculares) precisam estar em um lugar que seja acessível para outros pesquisadores. Esses bancos de dados servem para isso. É como se fosse um grande museu de sequências moleculares, um museu virtual.
O mais famoso desses bancos de dados é o GenBank. Ele é o maior em termos de número de sequências de DNA. Uma grande dificuldade em trabalhar com taxonomia molecular em regiões tropicais, conhecidas por sua grande biodiversidade, é a incompletude desses bancos de dados.
Por exemplo, se obtemos a sequência de um determinado organismo, o que temos inicialmente é só uma sequência molecular. Se quero identificar esse organismo, preciso comparar essa sequência com alguma outra. E o caminho natural é comparar com as sequências que já estão nas bases de dados. Mas nas regiões tropicais, o número de espécies é tão grande que os bancos de dados são muito incompletos. A conclusão das análises para 180 mil indivíduos já sequenciados no projeto indica que mais de 95% das espécies identificadas se tratam de espécies ainda desconhecidas da ciência.
Mesmo quando obtemos a sequência de DNA para uma espécie, muitas vezes a consulta aos bancos de dados retorna um resultado nulo. Não haverá nada parecido, ou será associada com alguma coisa errada. Por exemplo, a sequência pode ser associada a um animal parecido, mas que se trata de uma espécie da Europa —, que foi o mais próximo (similar) encontrado no banco de dados.
O BioInsecta dará uma grande contribuição para completar esses bancos de dados, porque um grande número de sequências de insetos previamente desconhecidas da Amazônia — uma vez que a maior parte dos insetos do bioma não são conhecidos — serão inseridas no GenBank. E isso vai permitir que pesquisas futuras utilizem dados moleculares para estudar a diversidade de insetos no bioma.
Esse será um resultado muito importante do projeto — ajudar a completar os bancos de dados moleculares. Inclusive, no futuro, estudos mais aplicados envolvendo, por exemplo, conservação ou estudos de biogeografia — que buscam entender como os organismos evoluem no ambiente onde vivem — serão facilitados com a existência desses dados.
Haverá mais sequências disponíveis para diversos tipos de pesquisa, e também para estudos de taxonomia molecular que focam em grupos específicos, como, por exemplo, mosquitos (ordem Diptera) ou abelhas (ordem Hymenoptera). No futuro, ao obter a sequência de DNA para o grupo que estuda, o pesquisador poderá comparar com os bancos de dados, uma vez não estarão mais tão incompletos, permitindo encontrar sequências similares à sua sequência de interesse e até mesmo identificar determinada espécie através do uso de dados moleculares.
Amorim, D. S. e Rafael, J. A. 2025. O CTFB como suporte para análises de projetos em andamento. Fauna do Brasil nr. 02. Disponível aqui.
Biblioteca Virtual da Fapesp. Auxílio à pesquisa, Programa Biota Temático. Disponível aqui.
BioInsecta: Biomonitoramento de Insetos em Florestas Tropicais. Disponível aqui. (redes sociais @bio_insecta)
INCT-BioDossel: Insetos na Copa das Árvores. Disponível aqui.
Magrini, Leandro. 2025. Amazônias desconhecidas: o desafio de estudar os insetos muito acima do solo. Jornal da USP, abril. Disponível aqui.
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